Ветеринарная вирусология шпоры к экзамену

Фитовирусы растений
Гемивириды: 1-2 мол-лы одноцеп ДНК, форма 2 неполных икосаэдра, 18 на 20 нм, 22 общих капсомера. Поражает двудольн и однодольн раст (кукуруза, фасоль, молочай, маниока, томаты, табак). Тип предст вирус полосатости кукурузы: в результате медленного персистирующего размножения клетки теряют способность к синтезу хлорофилла и возникает хлоратическая исчерченность листьев. Распростр цикадками. Белокрылками.
Фикодновириды: кольц 2-х цепоч ДНК, капсид сферический диаметр 50 нм. Группа вирусов мозаики цветной капусты (хлоритическое пожелтение жилок, скруч листьев, задержка роста и гибель). Распростр-тли.
Потивириды: 1 цеп РНК, нитевид капсид спирального типа симметрии. Х-вирус картофеля 600 и 10 нм, крапчатая мозаичность листьев. Распростр путем механическ контакта. У-вирус 900 и 15-20 нм, боле широкий спектр хозяев:кукуруза, турнепс, арбуз, морковь, просо. Вызыв полосчатый некроз жилок вдоль листа, распростр тлями.

Тобановириды: 1 цеп. РНК, палочковидной формы, 300 и 30-40 нм. Вирус табачной мозаики, хозяева: табак, свекла, картофель, нарциссы. Передача ч-з семена, механ путем.

Томбусвириды: 1 цеп нитев ДНК, спиралтный тип симметр, 30 нм, хозяева многие покрытосем раст. Вирус кустистой карликовости томатов, передача механическим путем.

Комовидиды: 2-х фрагмент 1 цеп +нить РНК, кубич тип симметрии, 30 и 30 нм. Пораж картофель, бобы, клевер. Вирус мозаики коровьего гороха, предача-тли.

Бромовидиды: 3-х фрагмент нить РНК, куич тип симметр, 25 нм, вирусы группы мозаики костра:малина, виноград, томаты. Передача: механич контакт, тли.

Фитореовирусы: 10-ти фрагмент 2-х цеп РНК, куб тип симетр, шаровид формы до 70 нм. Возд раневых опухолей клевера, вирус карликовости риса. Перенос цикадки, тли.

Фиторабдовирусы: 1 цепоч –нить РНК, спиральн тип симмтр. Пулевидн форма, 400 и 100 нм. Тли и цикадки –биолог переносчики. Вирус способен размн и накапл в их организме. Вирус енкротич желтухи латука, карликовости картофеля. Пораж табак, картофель, томаты, георгины.

Фитотоговирусы: 1 цеп +нить РНК, куб тип симметр, 30 нм, в составе вириона нет липидов. Вирус хлоорачитеской карликовости кукурузы. Передача цикадки.

Вирусы беспозвоночных
Бакулоновириды:
Эубакуловирины образ цитоплазм, внутриядерн включ.
Нуклеополиэдровирус (полиэдроз) 2-х цеп ДНк, куб тип симметр. При репродукции обрах вкл в ядре к-к хозяев в виде кристаллич моногран тел.
Грануловирус (гранулез) образ вкл в виде округлых или оавльных тел в ядре или в цитоплазме.
Пораж многих насек. Особ чувтвит личинки: происходит разжижжение тк и они погибают тк едят зараж растение или погиб личинок
Иридовириды: ДНк сод радужные вирусы. В тк зараж насек формир вкл-флюорохромы, котор дают характерное радужное свечение.
Хлорирдовирус крупный ирисцент вирус. Пораж насек, в их к-ках образ вкл с зелен-желт свечением
Иридовирус малый иридисц вирус, в к-ках тк лич образ вкл с сине-фиолет свечением.
Хозяева: двукрылые, жесткокрыл. 1 мо-ла «-х цеп ДНК, кодир много структур белков, н-ко вирионных ферментов.Форма икосаэдра. Суперкапсид, 125-300 нм. Цикл разсития преимущ в ц-ме, вкл образ там же. Тк личинки раздуваются, она теряеи подвижность и погибает. Репрод по умеренному типу, дочерн вирусы освобож путем почкования.
Денсовирус род подсем-ва денсовирины сем-ва парновириды. 1 мол-ла 1 цеп. ДНК, куб тип симметр. Мелкие 18-26 нм, 32 капсомера, просто устр. Доминир внутриядерн тип репродукции. Вирионы уст к изм рН и Т среды.Хоз: бабаочки-совкив лич ст, хронич паралич пчел.
Циповирус из сем-ва реовириды. 10-12 фраментов, 2-х цеп РНК, кодир 6-10 полипеттидов, ф-ты (обрат транскриптаза).Тип симметрии кубич., им 2 капсид оболочки. Пораж лич бабочек, перепонч, двукрыл. Цитоплазм тип репрод. Формир вкл кристаллов. Снач перинуклеарно. Затем по всей цитоплазме. Выявл в фиксир препаратах при окрашивании Конго красным.
Полидновириды: 2-х цеп мол-ла ДНК, куб тип симметрии, просто устроенные, мелкие 20-30 нм, пораж в осн насек эндопаразитов
Бракониды: ихновирус, броковирус. Не образ фиксир вкл, д

вкл, диффузное поражение, цмкл представлен пропорционально.
Подсеем-во энтомопоксивириды сем-ва поксивириды. ДНК содержащие. Гл проявл при поражении личиноу ядерный полиэдроз. Инфиц жестко, чешуе, двукрылых. Например, вирус желтухи тутового шелкопряда.

Вирусы позвоночных
Хордопоксивирусы:
Ортопоксивирус-возб оспы КРС, верблюдов, обезьян, вирус осповакцины, вирус натуральной оспы человека.
Парапоксивирус – пустулезный стоматит КРС, узелковое заболевание доильщиц.
Авипоксивирус – вирус оспы птиц :кур, канареек, голубей, воробьев, перепелов. Передача кровососущ насекомыми.
Каприпоксивирус – вирусы оспы овец, коз (бугочатость кожи). Перед кровососущ насек.
Лепорипоксивирус – опухолеподобн заболев зайцеобр и сем-ва беличьих: миксомы и фибромы у зайцев. Фибромы у белок, перед членистоногие
Циупоксивирус – оспа свиней

Группа неклассифицируемых поксвирусов: в контагиозного моллюска (содержимое узелка сод тельца, напомин моллюска), в тана, в яба обезьяний опухолевый. Общее: выызв доброкач опухоли.

Парагрипп КРС.
1. Сем.: парамиксовирусы.
2. Вирус - РНК-содержащий, может быть сферической, овальной. нитевидной формы; антигеностабилен; близок в антигенном отношении к вирусу парагриппа-3 человека. Диаметр вируса -120-300 нм, он имеет гемагглютинин, не обладает высокой устойчивостью.
3. Болеет КРС, главным образом, телята овцы. Остро протекающая контагиозная вирусная болезнь характеризуется поражением органов дыхания. Патологоанатомические изменения в основном наблюдаются в органах дыхания: в легких уплотненные участки красного цвета, признаки эмфиземы, гиперемии; слизисто-гнойный экссудат в трахее и бронхах; признаки ринита. Заражение воздушно-капельным путем, возможно - перорально и половым путем.
Для репродукции вируса широко применяют первичные культуры клеток почки, легкого, тестикулов, других органов КРС; размножение сопровождается ЦПЭ, образованием эозинофильных включений в плазме и ядрах клеток.
Для исследования берут от больных животных смывы со слизистой оболочки носовой полости, пробы крови в первые три дня болезни и через три недели, смывы с конъюнктивы и слизистой оболочки прямой кишки; от убитых с диагностической целью животных берут кусочки легких и бронхов, селезенки; лимфоузлы; миндалины; пораженные участки слизистой носовой и ротовой полости, трахеи, ЖКТ и пробу криви.
4. Диагноз основан на анализе эпизоотологических, клинических, патологоанатомических изменений и результатов лабораторных исследований - обнаружение антигена в патологическом материале (мазках-отпечатках, срезах), полученном от больных животных в РИФ (экспресс-диагностика), выделение возбудителя из патологического материала в культуре клеток почки эмбриона коровы (ПЭК) или легких эмбриона (ЛЭК) и его идентификация в РТГА, РИФ и др., выявление антител в сыворотке крови больных и переболевших животных в РТГА (ретроспективная диагностика).
Заражение естественно восприимчивых животных применяют редко вследствие дороговизны и трудности подбора телят, не имеющих специфических антител.
5. Переболевшие животные в течение 3 мес невосприимчивы к повторному заражению.
Для профилактики применяют живые и инактивированные вакцины.

Аденовирус КРС.
1. Сем.: аденовирусы.
2. Вирус - РНК-содержащий: имеет капсид двадцатигранной формы, состоящий из капсомеров; размер вируса - около 70-90 нм; он обладает гемагглютининами; имеются антигенные разновидности; цито-патогенный вирус; довольно устойчив к физическим и химическим факторам.
3. Болеет КРС, чаще всего телята от 2-недельного до 1-4-месячного возраста, инфекция широко распространена во многих странах; поражаются органы дыхания, пищеварения и зрения: повышение температуры тела достигает 41,5°С, характерны слезотечение, серозное истечение из носа, кашель, затрудненное дыхание, тимпания, колики, диарея.
Патологоанатоминеские изменения с признаками геморрагического катарального гастроэнтерита, очагового уплотнения, ателектаза, эмфиземы легких.
В результате исследований в эндотелиальных клетках сосудов печени, почек, селезенки, слизистой оболочки желудка и кишечника находят внутриядерные включения.
4. Диагноз основан на анализе эпизоотологических, клинических. патологоанатомических изменений и результатов лабораторных измерений.
Взятие патматериала происходит так же, как при инфекционном ринотрахеите. Лабораторная диагностика включает обнаружение антител в патологоанатомическом материале (мазках-отпечатках, срезах), полученном от больных животных, в РИФ и РСК; выделение возбудителя из патологического материала в культуре клеток тестикул бычка (ТБ), ПЭК или ЛЭК и его групповая идентификация в серологических акциях: РСК, РДП и РИФ; выявление антител в сыворотке крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в серологических реакциях: РСК, РНГА, РДП.
5. Переболевшие и вакцинированные телята приобретают иммунитет к заражению вирусом гомологичного типа. Пассивный иммунитет создают аденовирусные антитела молозива матери. Применяется инактированная вакцина из штаммов двух серологических групп аденовирусов.

Бешенство.
1. Сем.: рабдовирусы (греч. рабдос - стержень, палочка).
2. Вирус - РНК-содержащий, пулевидной формы, длина 180 нм. толщина - 70-80 нм, спиральный тип укладки, имеет наружную оболочку с булавовидными выпячиваниями, гемагглютининов нет. Нейротропный; вирус имеет 4 серотипа.
3. Болеют все млекопитающие, чувствительны и птицы, но в значительно меньшей степени. Болеет человек. Болезнь распространена на всех континентах. Домашние животные чаще всего заражаются при покусах больными дикими животными (лисами, волками и др.). Болезнь почти всегда кончается смертельно.
Клинические симптомы бешенства у всех животных сходны и характеризуются поражениями центральной нервной системы (у собак бывает буйная или тихая паралитическая форма). От места внедрения (обычно укуса) вирус движется к головному мозгу по нервным стволам. Это движение занимает от 10 дн. до нескольких месяцев в зависимости от места внедрения, чем определяется большой инкубационный период.
Вирус размножается в головном мозгу, при этом поражаются нейроны и вызывают клиническую картину бешенства.
Патологоанатомические изменения при бешенстве неспецифичны.
4. Заподозрить бешенство можно по клиническим признакам при вероятности наличия бешенства на этой территории (эпизоотологичес-кие данные).
Окончательный диагноз на бешенство может быть поставлен только на основании лабораторных исследований материала от больного животного (посмертно). Материал для исследования; голова павшего животного, а в случае, если животное мелкое, - труп целиком.
Экспресс-метод - обнаружение вирусного антигена с помощью РИФ, РДП, а также телец Бабеша-Негри в различных отделах головного мозга (аммонов рог. кора полушарий, мозжечок и продолговатый мозг) павших
животных.
Вирусологические методы. При отрицательных результатах экспресс-метода ставят биопробу на молодых мышатах (заражают интрацеребрально не менее 12 мышей), результат учитывают путем исследования мозга павших мышей в РИФ, РДП и по обнаружению телец Бабеша-Негри.
5. Иммунитет. Механизм поствакцинального иммунитета окончательно не расшифрован. Имеют значение вируснейтрализующие антитела в крови, особенно в ликворе, устойчивость клеток мозга к виpycy. Для специфической профилактики бешенства используют живые и инактивированные вакцины, которые можно применять даже сразу после заражения, учитывая большой инкубационный период. Исполъзуют следующие вакцины: сухая антирабическая фенолвакцина. антирабическая АзВИ, антирабическая этанолвакцина.
антирабическая инактивированная сухая вакцина из шт, "Щелково -51", выращенная в КК ВНК-21.

Грипп кур.
1. Сем.: ортомиксовирусы.
2. Вирус - РНК-содержащий, сферической формы, размером до 120 нм, имеет суперкапсид, репродукция в ядре и цитоплазме; разливают три типа возбудителя - А, В, С. Вирус гриппа А вызывает болезнь человека, свиней, лошадей, птиц; вирусы гриппа В и С поражают только человека. Вирус обладает гемагглютинирующими свойствами и нейраминидазной активностью.
Вирус малоустойчив к факторам физического и химического воздействия.
3. Гриппом болеют свиньи, лошади, птица (куры, утки, индейки, гуси, фазаны и др.), а также человек.
Грипп распространен на всех континентах, передается от больных здоровым аэрогенно и алиментарно.
Болезнь у животных всех видов характеризуется лихорадкой и поражением органов дыхания, заканчивается обычно выздоровлением, если не произошло бактериальное осложнение, но у кур смертность достигает 80 %. Грипп кур типа А-1 ранее называли классической чумой птиц.
4. Предварительный диагноз на грипп у всех поражаемых видов животных ставят на основании анализа эпизоотологических данных и клинических симптомов (патологоанатомические изменения нехарактерны).
Для окончательного диагноза необходимы результаты лабораторного исследования.
Материал для исследования: выделения слизистой оболочки носа, смывы от больных животных или бронхиальный экссудат, кусочки легких от павших животных; тру

труп целиком (птица).
Экспресс-метод. Постановка РГА и РИФ. Антиген обнаруживается в цитоплазме эпителиальных клеток.
Вирусологические методы:
а) выделение вируса осуществляется путем заражения КЭ в аллантоисную и амниотическую полости: белых мышей (интраназально); КК почек поросенка и др.
б) идентификация вируса: постановка РИФ, РГА и РТГА, а также РСК с использованием выделенного антигена (вируса) и известных специфических сывороток.
Ретроспективный метод заключается в обнаружении специфической способности антител сыворотки крови больных и переболевших птиц подавлять гемагглютинирующее действие вируса РТГА.
Выявление титров 1:4 и выше у отдельных птиц дает основание для проведения вирусологических исследований с целью выделения и идентификации вируса.
Выделенный и типизированный со специфическими сыворотками вирус служит основанием для постановки диагноза,
5. У переболевших животных иммунитет относительно непродолжительный. Для специфической профилактики гриппа у лошадей, кур, уток применяют живые и инактивированные вакцины. Например, эмбрион-вакцина против гриппа птиц типа "А".
Специфическая профилактика гриппа свиней не разработана.

ферменты, которые изменяют метаболизм инфицированной клетки, и она начинает синтезировать компоненты, необходимые вирусу. Еще одно биохимическое отличие ДНК бактериофага состоит в том, что к ее гидроксиметилцитозину присоединены остатки глюкозы: последние, видимо, препятствуют прерыванию фаговой ДНК некоторыми ферментами хозяина.
В противоположность этому у вирусов животных ДНК почти не подвергается модификациям. Например, хотя ДНК клеток-хозяев и содержит много метилированных оснований, у вирусов имеется в лучшем случае лишь несколько метильных групп на геном. Большинство вирусных дезоксинуклеотидов не модифицированы, и поэтому нахождение несомненных модификаций представляло бы большой интерес.
Исследования вирусной РНК составили один из самых значительных вкладов вирусологии в молекулярную биологию. Тот факт, что у вирусов растений реплицируемая генетическая система состоит только из РНК, ясно показал, что и РНК способна сохранять генетическую информацию. Была установлена инфекционность РНК вируса табачной мозаики, и выяснилось, что для инфекции необходима вся ее молекула; это означало, что интактность структуры высокомолекулярной РНК существенно для ее активности. Размеры вирионов РНК - вирусов сильно варьируются, однако размеры РНК и, следовательно, объем содержащейся в ней информации различаются в значительно меньшей степени.
РНК пикорнавирусов - вероятно, наименьшая из известных - содержит около 7500 нуклеотидов, а РНК парамиксовирусов - едва ли не самая крупная - почти 15000 нуклеотидов. По-видимому, всем независимо реплицирующимся РНК-вирусам нужен какой-то минимум информации для репликационной системы и капсидного белка, но у них отсутствует очень сложная добавочная информация, которой могут обладать крупные ДНК-вирусы.

физическая и биологическая инактивация вирусов не всегда совпадает. Чаще всего эти понятия совпадают в случае простых вирусов, у которых отсутствуют специализированные структуры, ответственные за заражение клеток, а физическая и химическая структура вирусных частиц отличается высокой степенью гомогенности и одинаковым уровнем чувствительности по отношению к различного рода воздействиям. У более сложных вирусов очень часто биологическая инактивация связана с повреждением специализированных структур, определяющих адсорбцию вирусной частицы или введение в зараженную клетку нуклеиновой кислоты, хотя вирусный корпускул в целом остается неповрежденным. Из рассмотрения данных о стабильности вирусных частиц и изменений данной характеристики в процессе мутации становится очевидным, что какой-либо универсальной закономерности в этом отношении установить нельзя. Стабильность вируса к тем или иным физическим и химическим факторам определяется всей совокупностью особенностей первичной, вторичной и третичной структуры белка и нуклеиновой кислоты, а также их взаимодействием.

4. Систематика вирусов. Основные систематические группы.
Классификация.
а)Вирусы классифицируются по сердцевине:
ДНК-содержащие и РНК-содержащие (ретро) вирусы.
б)По структуре капсомеров.
Изометрические (кубические), спиральные, смешанные.
в)По наличию или отсутсвию дополнительной липопротеидной оболочки
г)По клеткам-хозяинам
Кроме этих классификаций есть еще много других. На пример, по типу переноса инфекции от одного организма к другому.
Семейство Picornaviridae. (pico-маленький, RNA)
Вирион лишен суперкапсида, кубической формы, 22-30 нм. Липидов и углеводов в составе нет. Геном - односпиральная, линейная РНК. Размножение происходит в цитоплазме клеток.
Семейство Flaviviridae (flavus – желтый).
Флавивирусы – большая группа вирусов, поражающая позвоночный и насекомых. Вирионы представляют собой сферические частицы диаметром 40-60 нм. Нуклеокапсид имеет икосаэдрическую форму и покрыт наружной липопротеиновой оболочкой. Геном представлен одной одноцепочечной нитевидной молекулой РНК. Размножение вируса происходит в цитоплазме, созревание вирионов происходит почкованием через внутрицитоплазматические мембраны и везикулы.
Семейство Birnaviridae.
Бирнавирусы – небольшая группа вирусов, поражающая позвоночных, беспозвоночных и насекомых. Вирионы представляют собой сферические частицы диаметром 60 нм. Они состоят из сердцевины, содержащей РНК и белок и икосаэдрического капсида, построенного и 92 капсомеров. Вирионы содержат 90% белка, 10% РНК, липидов нет. Геном представлен двумя фрагментами 2-спиральной линейной РНК.
Семейство Herpesviridae.
Герпесвирусная инфекция – самая распространенная среди людей и животных. В семейство входят вирусы поражающие ЦНС (энцефалит, миелит, энцефаломиелит), глаза (кератит, кератоконьюнктивит), слизистые оболочки (афтозные язвы, стоматит, поражение гениталий), кожные покровы (экзема, везикулярные воспаления). В семейство герпесвирусов входят вирусы вызывающие такие болезни животных как:

Автор работы: Пользователь скрыл имя, 29 Октября 2013 в 16:47, шпаргалка

Работа содержит ответы на вопросы по дисциплине "Вирусология"

вирусология.docx

Диплоидные клетки получают из различных тканей эмбриона человека (легкие, почки, кожно-мышечная ткань, сердце и др.) и животных (почки эмбриона крупного рогатого скота, свиней, почки хомяка). Диплоидные клетки в отличие от перевиваемых имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пассажей 50 ± 10, затем количество делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Однако диплоидные клетки могут быть использованы в течение длительного времени, так как при каждом пассаже часть клеток можно заморозить (-196°С) и при необходимости восстановить. Диплоидные клетки имеют преимущества перед перевиваемыми и первичными клетками: 10-12 дней они могут быть в жизнеспособном состоянии без смены питательной среды; при смене среды один раз в неделю остаются жизнеспособными в течение 4 недель; особенно пригодны для длительного культивирования вирусов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к вирусам. Суспензионные культуры клеток. В 1953г. Оуэне с сотрудниками показали способность клеток размножаться в свободносуспендированном состоянии. В последующие годы этот метод был значительно усовершенствован: была создана современная аппаратура, обеспечивающая размножение клеток со строго заданными параметрами (температура, рН, скорость перемешивания), а также адаптированы многие линии перевиваемых клеток к размножению в этих условиях. Выращивание вирусов в суспензионных культурах клеток открывает большие возможности в промышленном производстве вакцин и диагностикумов. Однако только перевиваемые клетки хорошо культивируются в суспензии. Новый подход к культивированию клеток в суспензии - применение микроносителей (сефадекс, силикагель, цитолар и др.). На микроносителях культивируемые клетки формируют монослой.

Таким образом, этот способ позволяет методами суспензионного культивирования выращивать зависимые от прикрепления к твердому субстрату клетки: первичные, субкультуры, диплоидные. Эти клетки принято называть поверхностно зависимыми. Способ культивирования на микроносителях в настоящее время чрезвычайно популярен, так как он открывает большие перспективы в клеточной биотехнологии, в получении вакцин и других биологически активных веществ (интерферон, гормоны и т.д.). Хранение культур клеток. Каждый из трех основных типов клеточных культур - первичных культур, диплоидных штаммов и перевиваемых линий клеток, используемых в вирусологических исследованиях, часто приходится консервировать, так как при продолжительном пассировании клеток in vitro есть опасность бактериального загрязнения и неконтролируемых (генетических) изменений самих клеток.

Выделенные изоляты, как и штаммы стандартных вирусов, необходимые для сравнения и серологических исследований, следует хранить в условиях, обеспечивающих им максимально длительную жизнеспособность. При рН среды 7,0-7,4 и внесении в нее определенных добавок вирус можно хранить при 4° в течение нескольких недель, а некоторые виды - в течение года без потери инфекционных свойств.

Многие вещества обладают консервирующим или защитным свойством по отношению к вирусам. Чаще всего используют глицерин, который обладает бактериостатическим действием, но в то же время и защищает вирусы. Его применяют в качестве добавок к вируссодержащему материалу в количестве 10-40%. Довольно широко применяется также фенол, который в концентрации 0,2-0,5% большинство вирусов не инактивирует (например, вирусы чумы свиней, болезни Ауэски, ящура). Для консервирования вирусов можно использовать 5-20%-ный раствор NaCI, 10%-ный раствор глицерина, 0,15 M раствор KCI. Стабильность вирусов значительно увеличивается в результате добавления 1-10% глюкозы, сахарозы или мальтозы, 10-50% сыворотки или сывороточного альбумина, 10-50% обезжиренного молока, 0,1-2,0% желатина. Чем меньше белка в вируссодержащей взвеси, тем меньше его стабильность. Поэтому очищенные вирусы быстро теряют свою биологическую активность.

При хранении вирусов целесообразно также использовать полимеры: 0,5-3%-ную метилцеллюлозу или 0,1-2%-ный поливиниловый спирт. Хорошим стабилизирующим действием на некоторые вирусы обладает 5%-ный ДМСО (диметилсульфоксид), проявляющий при этом и антибактериальные свойства. Вирусы в культуральной жидкости стабилизируются компонентами питательной среды (сыворотка, гидролизат и др.).

Таким образом, большинство вирусов можно сохранять при температуре 4 o С в течение нескольких недель и даже нескольких лет при условии добавления указанных выше компонентов-стабилизаторов. Однако известно, чем ниже температуры замораживания вируса, тем дольше сохраняется его жизнеспособность. При быстром замораживании небольших количества вируса до минус 190°С с последующим хранением при этой температуре практически не снижается титр вируса. Такая температура, однако, очень редко используется в диагностической работе. В лабораториях хорошие результаты дает сохранение вирусов при температуре минус 70°С.

Использование стабилизирующих веществ необходимо не только при хранении вируса, но и для предотвращения потерь его в процессе самого замораживания, особенно вируссодержащих образцов экстраэмбриональной и культуральной жидкости. Если же в культуральной питательной среде содержится 2-19% сыворотки или гидролизата лактальбумина, то ее можно заморозить без добавления стабилизирующих веществ. Хорошее защитное действие при замораживании вирусов и хранении их в таком состоянии оказывает добавление к вируссодержащему материалу одного из таких компонентов, как 10-30% сыворотки крови, инактивированной при 56-60°С; 0,5-1,5% желатина; 20-50% обезжиренного молока; 0,1-0,5%

Шпаргалка Шпаргалка по "Вирусологии" Тип работы: Шпаргалка. Добавлен: 26.02.14. Год: 2013. Страниц: 12. Уникальность по antiplagiat.ru:

31. Принцип и практическое использование РН в вирусологии.
Основными составляющими компонентами этой реакции являются: иммунная вируснейтрализующая (опытная) и нормальная (контрольная) сыворотки одного и того же вида животного или человека; содержащий живые вирусы материал, являющийся антигеном; биологические объекты (мыши, куриные эмбрионы), на которых обнаруживают вируснейтрализующее действие иммунной сыворотки. Применяют два варианта постановки реакции нейтрализации. При одном из них берут постоянную дозу сыворотки и различные разведения вируса, при втором – постоянное разведение вируса и различные разведения сыворотки. Во всех случаях последовательность проведения реакции следующая:

Сыворотки получают либо от больных людей, либо применяют диагностические сыворотки от иммунизированных животных. Перед постановкой реакции сыворотки инактивируют, прогревая при температуре 56-60 0 С.
Антигены (вируссодержащие взвеси) получают из материала от больных вирусными инфекциями, готовят из органов и тканей заражённых вирусом животных, куриных эмбрионов, а также из инфицированных клеточных культур и подвергают очистке. Перед употреблением антиген титруют для определения его активности.
Биологические объекты выбирают с учётом свойств вируса, чувствительности самого объекта к действию вируса, а также задач и условий исследования.
Постановка реакции нейтрализации (I вариант)
Ставят для идентификации выделенного вируса. Для постановки реакции берут два ряда пробирок, из которых первый ряд является опытным, а второй – контрольным. В первый ряд пробирок наливают определённое количество неразведённой диагностической иммунной сыворотки, во второй – контрольный – такое же количество неразведённой нормальной сыворотки того же вида животного. Отдельно в пробирках готовят несколько разведений вируса, чтобы при добавлении их в пробирки опытного, контрольного ряда получились последовательные 10-кратные разведения вируса (например, 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 и т.д.). Сыворотки и добавляемые разведения вируса должны быть в одинаковых объёмах, например по 0,2 мл. Пробирки с приготовленной смесью ставят в термостат при температуре 37 0 С обычно на 1-2 часа. После этого опытные и контрольные смеси вводят мышам или в куриные эмбрионы. Каждым разведением для достоверности опыта заражают не менее 4 мышей или куриных эмбрионов.
За заражёнными животными ( опытными и контрольными) устанавливают наблюдение в течение 2-х недель, регистрируют заболевших и погибших мышей. Учёт реакции проводят путём сопоставления количества погибших опытных и контрольных мышей от соответствующего разведения вируса. Определяют 50%-ную смертельную дозу – LD₅₀, проводя подсчёт по Риду и Менчу. Высчитывают индеек нейтрализации (ИН) по формуле, определяющей количество доз, нейтрализуемых сывороткой:
Титр вируса в опыте с нормальной сывороткой
ИН = ------------------------------ ------------------------------ --------
Титр вируса в опыте с иммунной сывороткой
ИН менее 10 – отрицательный;
ИН – 11-49 – сомнительный;
ИН равный 50 и выше – положительный.
Заражённые эмбрионы инкубируют при температуре 35-37 0 С от 48 до 72 ч. Затем яйца вскрывают, аллантоисную или амниотическую жидкость отсасывают и в ней определяют наличие вируса при помощи реакции гемагглютинации. Если гемагглютинация наступила в контроле (смесь нормальной сыворотки с разведениями вируса) и отсутствует в опыте (смесь иммунной сыворотки с разведениями вируса), то сыворотка обладает нейтрализующим действием, Конечный титр вируса в контроле и в опыте определяют путём статистической обработки.
Постановка реакции нейтрализации (II вариант)
Реакцию ставят с различными разведениями исследуемой сыворотки и постоянной дозой известного живого вируса. Для этого к двукратным возрастающим разведениям сыворотки добавляют равные объёмы определённого разведения вируса (рекомендуется брать 100 или 1000 LD₅₀ вируса). Далее поступают как и в I варианте, то есть выдерживают опытные и контрольные смеси 1-2 часа в термостате, после чего вводят их мышам или куриным эмбрионам.
При постановке реакции нейтрализации на мышах за титр изучаемой сыворотки принимают разведение, дающее защитный эффект у 50% мышей. В реакции на куриных эмбрионах титром сыворотки считается то наибольшее её разведение, которое ещё способно задержать гемагглютинирующее действие вирусов у 50% заражённых куриных эмбрионов.

44. Как осуществляется поддержание вирусных штаммов в лабораторных условиях (пассажи, консервация)?
Пассаж вируса, проведение микроба (resp. вируса) через организм восприимчивого животного с целью усиления вирулентности; метод впервые предложен Пастером. Животное заражается микробом; затем его убивают или оно гибнет, и из его органов выделяют чистую культуру, вновь заражая ею новое животное и повторяя эту процедуру любое число раз. Можно пассировать также органы, заражая животное культурой микроба и вводя новым животным эмульсию органов зараженного. Чистая культура выделяется только после известного числа пассажей.
Метод размножения вирусов в культурах клеток: Культура клеток - это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма (in vitro). Методика культивирования клеток особенно успешно стала развиваться после 40-х годов текущего столетия. Этому способствовали следующие обстоятельства: открытие антибиотиков, предотвращающих бактериальное заражение культур клеток, открытие Хуангом (1943) и Эндерсом (1949) способности вирусов вызывать специфическую деструкцию клеток (цитопатический эффект) - удобный метод индикации вирусов в культурах клеток, и, наконец, Дульбекко и Фогт (1952) предложили методику трипсинизации тканей и?получения однослойных культур клеток. В вирусологической практике применяют следующие культуры клеток: первично-трипсинизированные культуры клеток - клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой. Культуру клеток можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного (взрослого или эмбриона). Однако лучше это удается сделать из эмбриональных органов, так как клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для этих целей используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных. Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 ч после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают их на кусочки (1-4 мм) и обрабатывают ферментами: трипсином, панкреатином, коллагеназой и другими (чаще трипсином). Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37°С. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делиться. В развитии культур клеток различают несколько фаз: адаптации, логарифмического роста, стационарную и старения (гибель клеток). Размножаясь, клетки размещаются на поверхности стекла и при полном покрытии его в один слой контактируют друг с другом и прекращают делиться (контактная ингибиция). На стекле формируется слой толщиной в одну клетку (поэтому эти культуры клеток называют однослойными или монослойными). Монослой сохраняет жизнеспособность в течение 7-21 дней.
Для культивирования вирусов используют молодые культуры клеток (как только сформировался монослой). Субкультуры. В вирусологической практике часто используют субкультуры, которые получают из первичных клеток, выращенных в матрасах, путем снятия их со стекла раствором версена или трипсина, ресуспендирования в новой питательной среде и пересева на новые матрасы или пробирки. Через 2-3 суток формируется монослой. Практически субкультуру можно получить из всех первичных культур клеток. (Хуже субкультивируются куриные фибробласты.) Субкультуры по чувствительности к вирусам не уступают первичным культурам клеток, кроме того, они более экономичны, и есть возможность выявления контаминации клеток вирусами. Субкультуры получают от 2-5 пассажей (перевивок) и очень редко до 8-10. Последующие пассажи приводят к изменению морфологии клеток и их гибели. Если клеточные культуры прошли более 10 пассажей, они уже на стадии перехода к перевиваемым культурам клеток. Перевиваемые культуры клеток - это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой (при условии замены питательной среды). Получают перевиваемые клетки из первичных культур клеток с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культивирования. Обычно работа по получению новых клеточных линий продолжается несколько месяцев. Полагают, что механизм происхождения перевиваемых культур клеток - результат генетической изменчивости клеток или селекции единичных клеток, присутствующих в первичной исходной культуре.
Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом (у первичных клеток он диплоидпый), стабильны в условиях роста in vitro, некоторые из них обладают онкогенной активностью. Последнее свойство ограничивает использование перевиваемых культур клеток для культивирования вирусов при производстве вакцин. Перевиваемые культуры клеток можно получать как из здоровых тканей животных, так и из опухолевых. Перевиваемые клетки имеют преимущества перед первичными: их приготовление значительно проще, экономятся труд и материальные средства; эти культуры заранее можно проверить на наличие латентных вирусов и микрофлоры; клональные линии обеспечивают более стандартные условия для размножения вирусов, чем первичные, представляющие смешанную популяцию клеток. Большинство перевиваемых клеток обладает более широким спектром чувствительности к вирусам, чем соответствующие первичные культуры. Поддерживают перевиваемые клетки путем периодических пересевов. Чаще используют бесцентрифужный метод. Для очередного пересева отбирают 2-3-дневную культуру с хорошим монослоем.

Диплоидные культуры клеток. Это морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся в процессе пассирования кариотипом, свойственным исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая туморагенной активностью при трансплантации хомячкам. Диплоидные культуры клеток, так же как и перевиваемые, получают из первичных культур клеток. Кариотип клеток очень лабилен и при обычных методах культивирования клеток он изменяется в первые дни. Поэтому потребовались специальные методы обработки ткани, питательные среды высокого качества, фетальная сыворотка для длительного поддерживания клеток in vitro в диплоидном состоянии.
Диплоидные клетки получают из различных тканей эмбриона человека (легкие, почки, кожно-мышечная ткань, сердце и др.) и животных (почки эмбриона крупного рогатого скота, свиней, почки хомяка). Диплоидные клетки в отличие от перевиваемых имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пассажей 50 ± 10, затем количество делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Однако диплоидные клетки могут быть использованы в течение длительного времени, так как при каждом пассаже часть клеток можно заморозить (-196°С) и при необходимости восстановить. Диплоидные клетки имеют преимущества перед перевиваемыми и первичными клетками: 10-12 дней они могут быть в жизнеспособном состоянии без смены питательной среды; при смене среды один раз в неделю остаются жизнеспособными в течение 4 недель; особенно пригодны для длительного культивирования вирусов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к вирусам. Суспензионные культуры клеток. В 1953г. Оуэне с сотрудниками показали способность клеток размножаться в свободносуспендированном состоянии. В последующие годы этот метод был значительно усовершенствован: была создана современная аппаратура, обеспечивающая размножение клеток со строго заданными параметрами (температура, рН, скорость перемешивания), а также адаптированы многие линии перевиваемых клеток к размножению в этих условиях. Выращивание вирусов в суспензионных культурах клеток открывает большие возможности в промышленном производстве вакцин и диагностикумов. Однако только перевиваемые клетки хорошо культивируются в суспензии. Новый подход к культивированию клеток в суспензии - применение микроносителей (сефадекс, силикагель, цитолар и др.). На микроносителях культивируемые клетки формируют монослой.
Таким образом, этот способ позволяет методами суспензионного культивирования выращивать зависимые от прикрепления к твердому субстрату клетки: первичные, субкультуры, диплоидные. Эти клетки принято называть поверхностно зависимыми. Способ культивирования на микроносителях в настоящее время чрезвычайно популярен, так как он открывает большие перспективы в клеточной биотехнологии, в получении вакцин и других биологически активных веществ (интерферон, гормоны и т.д.). Хранение культур клеток. Каждый из трех основных типов клеточных культур - первичных культур, диплоидных штаммов и перевиваемых линий клеток, используемых в вирусологических исследованиях, часто приходится консервировать, так как при продолжительном пассировании клеток in vitro есть опасность бактериального загрязнения и неконтролируемых (генетических) изменений самих клеток.
Выделенные изоляты, как и штаммы стандартных вирусов, необходимые для сравнения и серологических исследований, следует хранить в условиях, обеспечивающих им максимально длительную жизнеспособность. При рН среды 7,0-7,4 и внесении в нее определенных добавок вирус можно хранить при 4° в течение нескольких недель, а некоторые виды - в течение года без потери инфекционных свойств.
Многие вещества обладают консервирующим или защитным свойством по отношению к вирусам. Чаще всего используют глицерин, который обладает бактериостатическим действием, но в то же время и защищает вирусы. Его применяют в качестве добавок к вируссодержащему материалу в количестве 10-40%. Довольно широко применяется также фенол, который в концентрации 0,2-0,5% большинство вирусов не инактивирует (например, вирусы чумы свиней, болезни Ауэски, ящура). Для консервирования вирусов можно использовать 5-20%-ный раствор NaCI, 10%-ный раствор глицерина, 0,15 M раствор KCI. Стабильность вирусов значительно увеличивается в результате добавления 1-10% глюкозы, сахарозы или мальтозы, 10-50% сыворотки или сывороточного альбумина, 10-50% обезжиренного молока, 0,1-2,0% желатина. Чем меньше белка в вируссодержащей взвеси, тем меньше его стабильность. Поэтому очищенные вирусы быстро теряют свою биологическую активность.
При хранении вирусов целесообразно также использовать полимеры: 0,5-3%-ную метилцеллюлозу или 0,1-2%-ный поливиниловый спирт. Хорошим стабилизирующим действием на некоторые вирусы обладает 5%-ный ДМСО (диметилсульфоксид), проявляющий при этом и антибактериальные свойства. Вирусы в культуральной жидкости стабилизируются компонентами питательной среды (сыворотка, гидролизат и др.).
Таким образом, большинство вирусов можно сохранять при температуре 4 o С в течение нескольких недель и даже нескольких лет при условии добавления указанных выше компонентов-стабилизаторов. Однако известно, чем ниже температуры замораживания вируса, тем дольше сохраняется его жизнеспособность. При быстром замораживании небольших количества вируса до минус 190°С с последующим хранением при этой температуре практически не снижается титр вируса. Такая температура, однако, очень редко используется в диагностической работе. В лабораториях хорошие результаты дает сохранение вирусов при температуре минус 70°С.
Использование стабилизирующих веществ необходимо не только при хранении вируса, но и для предотвращения потерь его в процессе самого замораживания, особенно вируссодержащих образцов экстраэмбриональной и культуральной жидкости. Если же в культуральной питательной среде содержится 2-19% сыворотки или гидролизата лактальбумина, то ее можно заморозить без добавления стабилизирующих веществ. Хорошее защитное действие при замораживании вирусов и хранении их в таком состоянии оказывает добавление к вируссодержащему материалу одного из таких компонентов, как 10-30% сыворотки крови, инактивированной при 56-60°С; 0,5-1,5% желатина; 20-50% обезжиренного молока; 0,1-0,5%

Читайте также: